ジデオキシシーケンス（サンガーシークエンス）とパイロシークエンシングの違い

DNAの配列解析は、特定のDNA領域におけるヌクレオチドの正しい配列から多くの重要な情報を得ることができるため、非常に重要です。サンガーシーケンスとパイロシーケンスの大きな違いは、サンガーシーケンスはDNA合成のジデオキシヌクレオチド終結を利用して塩基配列を読み取るのに対し、パイロシーケンスは次のような方法で塩基配列を読み取ることです。塩基配列と合成相補配列の組み合わせにより、ピロリン酸の放出を検出し、その配列を読み取る。

目次 1. 概要と主な違い 2. サンガーシーケンスとは 3. フレームアイソレーションとは 4. 横並び比較 - サンガーシーケンスと熱分解シーケンス 5. まとめ

ジデオキシシーケンス（サンガーシークエンス）は何ですか？

サンガーシーケンスは、1977年にFrederick Sangerとその研究所によって開発された第一世代のDNA配列決定法である。ジデオキシヌクレオチド（ddNTPs）の鎖の終結に基づくため、ストランド・ターミネーション・シークエンスまたはジデオキシ・シークエンスとも呼ばれる。この方法は、正しい塩基配列や特定のDN**セグメントの付着を発見できるサンガーシーケンス技術であるNext Generation Sequencing（NGS）が登場するまでの30年以上、広く用いられてきた。これは、ddNTPの選択的なドーピングと、in vitroでのDNA複製中のDNA合成の終了に基づくものである。隣り合うヌクレオチド間でジニトロ3-リン酸塩が形成されるのが特徴である。したがって、ddNTPがリゲートされると、鎖伸長は停止し、その時点から終了する。サンガーシークエンスでは、ddntp-ddtp、ddCTP、ddGTP、ddTTPの4つのヌクレオチドが使用されている。これらのヌクレオチドが成長中のDNA鎖に結合すると、DNAの複製過程が阻害されて、長さの異なる短いDNAになる。キャピラリーゲル電気泳動は、図01に示すように、これらの短いDNA鎖をそのサイズに応じてゲルに配列するために使用されている。

図1：合成短鎖DNAのキャピラリーゲル電気泳動法

DNAを試験管内で複製するためには、いくつかの要件を満たす必要があります。DNAポリメラーゼ酵素、鋳型DNA、オリゴヌクレオチドプライマー、デオキシリボヌクレオチド（dNTPs）である。サンガーシークエンスでは、4本のddntpを用いたDNA複製を4本の別々のチューブで行った。デオキシリボヌクレオチドは対応するddntpに完全に置換されていない。特定のdNTPの混合物（例：dATP+ddATP）をチューブに含ませ、複製した。4種類のチューブ製品を、4つのウェルでゲル上に走らせる。その後、ゲルを読み取ることで、図02に示すような配列を構築することができる。

図02：サンガーシークエンス

サンガーシークエンスは、分子生物学の多くの分野で役立っている重要な技術である。サンガーシーケンシングは、標的DNAの塩基配列決定、がんや遺伝病の研究、遺伝子発現解析、ヒトの識別、病原体の検出、微生物の塩基配列決定などにも利用されています。

サンガーシークエンスにはいくつかの欠点があります。

• 配列決定するDNAの長さが1000塩基対を超えないこと
• 一度に配列できるのは1本だけです。
• この作業は時間とコストがかかる。

そのため、これらの問題を克服するために、新しい高度なシーケンサー技術が時代とともに開発されてきました。しかし、サンガーシークエンスは、約850塩基対の長さの断片で非常に正確な結果が得られるため、現在も使用されています。

パイロシークエンシングは何ですか？

ピロリン酸塩塩基配列は、「合成塩基配列」に基づく新しいDNA塩基配列決定技術です。この技術は、ピロリン酸の放出を検出するためにヌクレオチドの取り込みに依存している。このプロセスでは、DNAポリメラーゼ、ATPスルホニラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼという4種類の酵素と、アデノシン5'リン酸硫酸（APS）とルシフェリンという2種類の基質が使われます。

このプロセスは、まずプライマーが一本鎖のDNA鋳型に結合し、これにDNAポリメラーゼが相補的なヌクレオチドの結合を開始することから始まる。ヌクレオチドが結合する（核酸重合）と、ピロリン酸（2つのリン酸基が結合したもの）基とエネルギーが放出される。ヌクレオチドを添加するたびに、同量のピロリン酸が放出される。生成されたATPはルシフェラーゼを介し、ルシフェラーゼを酸化ルシフェリンに変換し、ATP量に比例した可視光を発生させる。光検出器または光電子増倍管で光を検出し、パイログラムを生成する。 アピラーゼは反応混合物中のATPと結合していないdNTPを分解する。dNTPは1つずつ添加する。光の混入と検出からヌクレオチドの添加がわかるため、テンプレートの配列を決定することが可能である。このパイログラムを用いて、図03に示すようなサンプルDNAの塩基配列を生成することができます。

ピロリン酸塩の塩基配列は、一塩基多型解析やショートフラグメントDNAの塩基配列解析において非常に重要である。ピロリン酸塩シーケンス技術は、サンガーシーケンス技術に比べ、高精度、柔軟性、自動化の容易さ、並列処理などの点で優位性があります。

図03：パイロシークエンス

ジデオキシシーケンス（サンガーシークエンス）とパイロシークエンシングの違い

概要 - ジデオキシシーケンス（サンガーシークエンス） vs. パイロシークエンシング

サンガーシークエンシングは鎖の延長を終了させることで塩基配列を構築するのに対し、ピロリン酸塩シークエンシングは塩基を結合し、ピロリン酸の遊離を検出することで塩基配列を正確に構築する、分子生物学で用いられる二つのDNA塩基配列決定方法である。したがって、ピロリン酸塩シーケンシングとの違いは、シーケンシングがシーケンシングによって終了することです。

参考文献：1. Fakruddin, M.D. and Abhijit Chowdhury. "Pyrophosphate sequencing is an alternative to traditional Sanger sequencing", American Journal of Biochemistry and Biotechnology.「ピロリン酸塩シーケンシングは従来のサンガーシーケンシングの代替法」, American Journal of Biochemistry and Biotechnology.Scientific Publications, March 2, 2012.Web. 2017年2月28日。"サンガー・シーケンス"Sanger Sequencing - ScienceDirect Topics. n, p., n.d. Web. 2017.02.28.