双脱氧测序法(sanger sequencing)和焦测序(pyrosequencing)的区别
DNA测序对于DNA分析是非常重要的，因为在特定的DNA区域正确的核苷酸排列可以揭示许多重要的信息。有不同的DNA测序方法。Sanger测序和焦磷酸测序是分子生物学中广泛应用的两种不同的DNA测序方法。Sanger测序和Pyrosequencing的关键区别在于Sanger测序使用双脱氧核苷酸终止DNA合成来读取核苷酸序列，而PyroSequence则通过结合核苷酸和合成互补序列来检测焦磷酸盐的释放，从而读取顺序。
内容1。概述和主要区别2。什么是Sanger sequencing 3。什么是火焰隔离4。并排比较——桑格测序与热解测序5。摘要
什么是双脱氧测序法(sanger sequencing)？
Sanger测序是Frederick Sanger和他的学院于1977年开发的第一代DNA测序方法。它也被称为链终止测序或双脱氧测序，因为它是以双脱氧核苷酸（ddNTPs）终止链为基础的。在新一代测序（NGS）出现之前，这种方法被广泛应用了30多年。Sanger测序技术能够发现正确的核苷酸顺序或特定DN**段的附着。它的基础是在体外DNA复制过程中选择性地掺入ddNTPs和终止DNA合成。邻接的核苷酸之间形成一个独特的特征，即二硝基-3-磷酸酯的形成。因此，一旦ddNTP被连接，链延伸停止并从该点终止。桑格测序中使用了四种ddntp-ddtp、ddCTP、ddGTP和ddTTP。当这些核苷酸与DNA的生长链结合在一起时，它们会阻止DNA的复制过程，并导致不同长度的短DNA。毛细管凝胶电泳用于将这些短DNA链按其大小排列在凝胶上，如图01所示。
图1：合成短DNA的毛细管凝胶电泳
对于DNA的体外复制，应提供很少的要求。它们是DNA聚合酶酶、模板DNA、寡核苷酸引物和脱氧核苷酸（dNTPs）。在Sanger测序中，DNA复制与四种ddntp分别在四个独立的试管中进行。脱氧核苷酸并没有被相应的ddntp完全取代。特定dNTP（例如：dATP+ddATP）的混合物包含在试管中并复制。四种不同的管产品在四个单独的油井中的凝胶上运行。然后，通过读取凝胶，可以构建如图02所示的序列。
图02：桑格测序
Sanger测序是一项重要的技术，在分子生物学的许多领域都有帮助。利用Sanger测序方法成功地完成了人类基因组计划。Sanger测序还可用于靶DNA测序、癌症和遗传病研究、基因表达分析、人类鉴定、病原体检测、微生物测序等。
桑格测序有几个缺点：
- 测序的DNA长度不能超过1000个碱基对
- 一次只能测序一条链。
- 这个过程既耗时又昂贵。
因此，随着时间的推移，新的高级测序技术被开发出来以克服这些问题。然而，Sanger测序仍然在使用，因为它的结果非常精确，大约有850个碱基对长度的片段。
什么是焦测序(pyrosequencing)？
焦磷酸测序是在“合成测序”的基础上发展起来的一种新的DNA测序技术。这项技术依赖于核苷酸掺入检测焦磷酸盐释放。该过程采用四种不同的酶：DNA聚合酶、ATP磺酰化酶、荧光素酶和apyrase以及两种底物腺苷5'磷酸硫酸酯（APS）和荧光素。
这个过程从引物与单链DNA模板结合开始，DNA聚合酶开始与之互补的核苷酸的结合。当核苷酸结合在一起（核酸聚合），它释放焦磷酸盐（两个磷酸基团结合在一起）基团和能量。每次核苷酸的加入都会释放等量的焦磷酸盐。在底物APS存在下，焦磷酸盐通过ATP磺酰化酶转化为ATP。生成的ATP驱动荧光素酶介导的荧光素酶转化为氧化荧光素，产生的可见光与ATP的量成正比。光被光子探测装置或光电倍增管探测，并产生一个热释光图。Apyrase降解反应混合物中的ATP和未结合的dNTPs。一次添加一次dNTP。由于核苷酸的加入是根据光的掺入和检测而知道的，所以可以确定模板的序列。如图03所示，热解图用于生成样本DNA的核苷酸序列。
焦磷酸测序在单核苷酸多态性分析和短片段DNA测序中具有重要意义。焦磷酸测序比桑格测序技术具有高精度、灵活性、易于自动化和并行处理等优点。
图03：焦测序
双脱氧测序法(sanger sequencing)和焦测序(pyrosequencing)的区别
| 桑格测序与焦测序 | |
| Sanger测序是一种基于DNA聚合酶选择性结合ddNTPs和链终止的DNA测序方法。 | 焦磷酸测序是一种基于检测核苷酸释放焦磷酸盐的DNA测序方法。 |
| ddNTP的使用 | |
| ddNTPs用于终止DNA复制 | 不使用DDNTP。 |
| 涉及的酶 | |
| 使用DNA聚合酶。 | 使用了四种酶：DNA聚合酶、ATP磺酰化酶、荧光素酶和Apyrase。 |
| 使用的基板 | |
| 不使用APS和荧光素。 | 使用5'磷酸腺苷（APS）和荧光素。 |
| 最高温度 | |
| 这是一个缓慢的过程。 | 这是一个快速的过程。 |
总结 - 双脱氧测序法(sanger sequencing) vs. 焦测序(pyrosequencing)
Sanger测序和焦磷酸测序是两种用于分子生物学的DNA测序方法。Sanger测序通过终止链的延伸来构建核苷酸的顺序，而焦磷酸测序则通过结合核苷酸和检测焦磷酸盐的释放来构建核苷酸的精确顺序。因此，焦桑格测序和焦桑格测序之间的区别在于测序是通过测序终止的。
参考文献：1。Fakruddin，医学博士和Abhijit Chowdhury。“焦磷酸测序是传统桑格测序的一种替代品”，《美国生物化学与生物技术杂志》。科学出版物，2012年3月2日。网状物。2017年2月28日。“桑格测序”。桑格测序-科学指导主题。N、 p.，N.d.网络。2017年2月28日
