DNA测序是一种用于确定特定DN**段核苷酸序列的技术。Sanger测序和下一代测序是两种测序方法。荧光标记用于识别序列中的每个核苷酸。PCR用于将荧光标记并入DN**段。聚合酶链反应（PCR）是一种在实验室中用来产生数百万份特定DN**段的技术。分析凝胶中的PCR片段可以确定DN**段的核苷酸序列。

覆盖的关键领域

1.什么是测序-定义，测序类型-下一代测序，Sanger测序2.为什么在DNA测序过程中使用PCR-在PCR过程中加入荧光染料

关键词：ddNTPs，dNTPs，DNA测序，荧光染料，下一代测序，PCR，Sanger测序

什么是排序(sequencing)？

测序是一种实验室技术，用于确定DNA分子的核苷酸序列。Sanger测序和下一代测序是DNA测序的两种主要方法。这两种DNA测序方法都涉及到通过PCR将荧光标记物掺入DNA链以测定特定DNA链的核苷酸序列。

双脱氧测序法

第一种测序方法，被称为Sanger测序，是由fredricsanger于1975年首次开发的，因此被称为Sanger测序。Sanger测序参与DNA聚合酶在体外DNA合成过程中选择性掺入链终止双脱氧核苷酸（ddNTPS）。因此，也称为链终止法。常规脱氧核苷酸（dNTPs）用于DNA链的延伸。DDNTP也被添加到反应混合物中以终止链增长。将四种DDNTP添加到四种不同的PCR混合物中。因此，通过添加ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP进行四种不同的PCR反应。对于每种反应混合物，添加一种ddNTP（如果添加了ddATP），不同扩增子的生长终止于DN**段中的每个（a）核苷酸。然后用凝胶电泳法对这四个反应进行分离。发射荧光由荧光计检测。Sanger测序技术被广泛应用于DNA克隆和PCR扩增片段序列的测定。Sanger测序的一般程序如图1所示。

Figure 1: General Process of Sanger Sequencing

下一代测序

下一代测序是最新DNA测序技术的总称。在下一代测序中，在一个芯片上同时进行几个测序反应。两种测序方法都使用荧光标记的核苷酸，这些核苷酸在PCR过程中被整合到扩增子中，从而可以测定核苷酸序列。荧光标记的链终止添加也参与了下一代测序。然而，Sanger测序和下一代测序的主要区别是在下一代测序中使用毛细管电泳分离不同标记的扩增子。毛细管电泳是一种基于分子的电泳迁移率来分离分子的分析分离方法。

为什么在dna测序过程中使用pcr

在测序过程中，应将荧光标记结合到DNA链中以测定核苷酸序列。这种结合发生在PCR过程中。一般来说，在PCR过程中，这四种dntp被整合到新合成的DNA链中。这种现象被用于DNA测序，在确定DNA序列时将荧光标记的双脱氧核苷酸（ddNTPs）加入到扩增子中。

一般来说，四种碱基的混合物（dNTPs；在DNA测序期间，将dATP、dGTP、dCTP、dTTP）添加到PCR反应混合物中。

此外，四种双脱氧核苷酸中的一种（ddNTPs；以低浓度添加ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP）作为PCR反应的组分。最后，必须进行四次PCR反应以确定完整的序列。

Figure 1: A Determined DNA Sequence

ddNTPs缺少3'-OH基团，DNA聚合酶将进入的核苷酸添加到3'-OH基团中。因此，ddNTP的加入终止了链的生长。因此，在四个PCR反应中，链终止都发生在特定的碱基上。这些DDNTP还与不同的荧光染料结合（ddATP用绿色染料标记；ddGTP用黄色染料标记；ddCTP用蓝色标记，ddTTP用红色染料标记）。荧光染料的掺入和链终止发生在PCR过程中。扩增子在凝胶上运行，凝胶通过自动测序仪中的荧光计进行荧光扫描，以确定核苷酸序列。

结论

DNA测序是一种实验室技术，用于确定特定DN**段的核苷酸序列。Sanger测序和下一代测序将不同的荧光染料结合到DN**段中，以便在PCR期间测定核苷酸序列。

引用

1.亚当斯，吉尔DNA测序技术〉，《自然新闻》，自然出版集团，这里提供。2.“DNA测序-荧光染料自动测序”，JRank文章，可在这里获得。 2.“DNA测序-荧光染料自动测序”，JRank文章，