ギャップ変換とエンドフィリングの大きな違いは、ギャップ変換が様々なハイブリダイゼーション反応に用いる標識DNAプローブを作成するプロセスであるのに対し、エンドフィリングは一本鎖のオーバーハングにヌクレオチドを付加してブラントフラグメントを生成する技術である点である。

ノッチ翻訳とエンドフィリングは、分子生物学でよく使われる技術である。ノッチ翻訳は、特定のヌクレオチド配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブの標識に使用されます。エンドフィリングは、末端が粘着性のある鈍い断片や、一本鎖のはみ出し部分に使用されます。どちらも非常に重要な技術であり、通常、分子研究所の中で行われている。

カタログ

1. 概要と主な違い 2. ニック翻訳とは 3. エンドフィルとは 4. ギャップ翻訳とエンドフィルの類似点 5. 横並び比較 - 表形式でのギャップ翻訳とエンドフィル 6. まとめ

ニック・トランスレーションは何ですか？

ギャップ変換は、ブロッティング、in situハイブリダイゼーション、蛍光in situハイブリダイゼーションなどの様々な分子生物学的手法の準備に使用される重要なDNA標識法です。DNAプローブは、特定のDNAまたはRNA配列を識別するために使用されます。標識プローブを用いることで、複雑な核酸混合物から特定の断片を標識または可視化することができる。そのため、様々な手法で標識プローブが調製される。ギャップ変換は、DNAase1とDNA polymerase1という酵素を使って、標識プローブを生成する方法です。

図01：ニックの翻訳

ギャップ変換のプロセスは、酵素DNase-1の活性によって始まり、ヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することで、二本鎖DNAのリン酸骨格にくぼみを導入する。ニックが形成されると、ヌクレオチドの3′OHラジカルが生成され、DNAポリメラーゼ1の酵素が作用する。DNAポリメラーゼ1の5′→3′核酸エキソヌクレアーゼ活性が、ニックからDNA鎖の3´方向へヌクレオチドを除去するのである。

同時に、DNAポリメラーゼ1酵素の多型活性が作用し、除去されたヌクレオチドに代わってヌクレオチドが付加されるのである。もし、ヌクレオチドが標識されていれば、標識されたヌクレオチドに置き換えられ、DNAが認識されるように標識される。最後に、この新しく合成された標識DNAは、様々なハイブリダイゼーション反応のプローブとして使用することができる。

穴埋めは何ですか？

エンドフィリングとは、分子生物学で用いられる、**破片を埋めるための技術である。制限酵素消化では、オーバーハングを持つフラグメントが生成されます。これらのフラグメントは、プラスミドベクターへのライゲーションに不適合な場合があります。ベクターは通常、相容れない末端を接着できるように鈍化されている。したがって、オーバーハングを持つフラグメントは、相補鎖にヌクレオチドを付加して重合鋳型として使用することで鈍化させることができる。これをエンドフィリングの工程といいます。

DNAポリメラーゼIやT4 DNAポリメラーゼのKlenowフラグメントなどのDNAポリメラーゼは、エンドフィリングの触媒として機能する。ヌクレオチドを加えて（5′→3′）埋め、（3′→5′）と噛むのです。粘着性のある末端が満たされると、鈍感になり、ベクターに連結する準備が整います。

また、エンドフィリングは、DNA分子の標識にも利用できる。ただし、末端が粘着性のあるDNA分子の標識にしか使用できない。エンドフィリングは、ニックトランスレーションに比べ、DNAの切断がほとんどない穏やかな方法です。

ニック翻訳と穴埋めの共通点

• ギャップ変換とエンドフィリングは、どちらも分子生物学的な手法です。
• プローブのラベルに使用することができます。
• いずれもin vitroで培養される

ニック翻訳と穴埋めの違い

ノッチトランスレーションは、ハイブリダイゼーション用の標識プローブを作成する技術である。一方、エンドフィリングは、ベクターへの接合に使用する鈍い断片を作る技術です。つまり、これがノッチ翻訳とエンドフィリングの重要な違いです。また、ノッチ翻訳には5′から3′の核酸エキソヌクレアーゼ活性が必要であるが、エンドフィリングには5′から3′の核酸エキソヌクレアーゼ活性は必要ない。

以下のインフォグラフィックは、切り出し翻訳とエンドフィルの違いをより詳しく説明しています。

概要 - ニック翻訳 vs. 穴埋め

ギャップ変換は、放射性同位元素で標識されたヌクレオチドをDNAに組み込む方法である。DNAase 1と大腸菌のDNA polymerase 1の酵素活性に基づいて標識プローブを合成する。一方、エンドフィリングは、鈍い破片を作る技術です。フラグメントがスティッキーエンド（一本鎖の張り出し）を持っている場合、ベクターにライゲーションするためには、その末端を鈍らせる必要がある。エンドフィリングは、ライゲーションに適合するように、適合するヌクレオチドを追加し、ブラントエンドの断片を生成するものである。そこで、本稿ではギャップトランスレーションとエンドフィリングの違いについてまとめてみた。

引用

New England Biolabs: Reagents for the Life Sciences Industry, available here. sciencedirect.Com, 2020, available here."Nick Translation - Overview". sciencedirect.Com 2020.