生物技术领域是一个不断变化的领域。尖端研究的快速增长和发展取决于科学家的创新和创造力，以及他们发现基本分子技术潜力并将其应用于新工艺的能力。聚合酶链反应（PCR）的出现为基因研究打开了许多大门，包括DNA分析和基于DNA序列识别不同基因的方法。DNA测序还取决于我们使用凝胶电泳分离大小相差仅一个碱基对的DNA链的能力。

dna测序

20世纪70年代末，发明了两种针对较长DNA分子的DNA测序技术：Sanger（或双脱氧）法和Maxam-Gilbert（化学裂解）法。Maxam-Gilbert方法基于化学物质对核苷酸的特异性切割，最好用于寡核苷酸（短核苷酸聚合物，长度通常小于50个碱基对）的测序。桑格方法更常用，因为它在技术上更容易应用，并且随着PCR技术的出现和自动化，它很容易应用于长链DNA，包括一些完整的基因。该技术基于PCR延伸反应中双脱氧核苷酸的链终止。

桑格法

在Sanger方法中，将待分析的DNA链用作模板，并在PCR反应中使用DNA聚合酶，使用引物生成互补链。制备四种不同的PCR反应混合物，每种混合物含有一定百分比的二脱氧核苷三磷酸（ddNTP）类似物，与四种核苷酸（ATP、CTP、GTP或TTP）中的一种类似物。

新DNA链的合成继续进行，直到这些类似物中的一个被合并，此时该链被提前截断。每一个PCR反应都将包含不同长度的DNA链的混合物，所有的DNA链都以该反应的双脱氧标记的核苷酸结束。然后使用凝胶电泳在四个单独的通道中分离四个反应的链，并根据链的长度和核苷酸的末端确定原始模板的序列。

在自动Sanger反应中，使用四种不同颜色荧光标记的引物。如上所述，在存在不同二脱氧核苷酸的情况下进行PCR反应。然而，接下来，将四种反应混合物合并并应用于凝胶的单一通道。使用激光束检测每个片段的颜色，并通过计算机收集信息，计算机生成显示每个颜色峰值的色谱图，从中可以确定模板DNA序列。

通常，自动测序方法仅适用于最大长度约为700-800碱基对的序列。然而，使用诸如引物行走和鸟枪测序等分步方法，可以获得较大基因的完整序列，事实上，也可以获得整个基因组。

在引物行走中，使用Sanger方法对较大基因的可行部分进行测序。新的引物是从序列的一个可靠片段生成的，用于继续对超出原始反应范围的基因部分进行测序。

鸟枪测序需要将感兴趣的DNA片段随机切割成更合适（可管理）大小的片段，对每个片段进行测序，并根据重叠序列排列片段。通过应用计算机软件来安排重叠部分，这项技术变得更容易了。