定点诱变（SDM）是一种在已知序列中产生突变的体外方法。它通常是通过基于PCR的方法来执行的。通常，一个或两个碱基在定点诱变中发生变化。引物可以设计为所需的突变，以引入核苷酸序列的微小变化。引物延伸和反PCR可用于大规模突变的引入。这种方法可能改变特定蛋白质的氨基酸组成。利用定点诱变技术研究蛋白质活性的变化。它也被用来创造融合蛋白。

覆盖的关键领域

1.什么是定点突变（SDM）-定义、作用、方法2.如何设计用于定点突变的引物-替换、缺失、**

关键词：缺失、**、突变、定点诱变、替换、传统PCR

什么是定点突变(site-directed mutagenesis)？

定点突变是一种分子生物学技术，用于改变基因的核苷酸序列。它用于改变蛋白质的氨基酸序列，引入或去除限制性位点，破坏转录结合位点，并产生融合蛋白。

过程

在定点突变过程中，利用引物将突变导入质粒，包括所需的突变。整个模板通过PCR扩增，将突变整合到模板中。然后，用甲基化依赖性内切酶从样品中去除母体模板。将PCR产物或带有期望突变的缺口质粒分子转化为细菌。质粒可以通过所需的修饰从细菌中分离出来。定点突变过程如图1所示。

Figure 1: Site-Directed Mutagenesis

三种主要的方法被用来在定点突变中引入所需的突变。它们是传统的PCR、引物延伸和反向PCR。引物延伸和反向PCR可用于引入大规模核苷酸变化。

传统pcr

传统的PCR方法可以通过修饰引物将一个或两个核苷酸的变化引入靶序列。这些变化可以是核苷酸替换、缺失或增加。在PCR过程中，突变被整合到扩增子中。因此，原始序列被引物中的突变序列所取代。

底漆延伸

在引物延伸中，所需的突变在巢式PCR中被合并。在这里，目标序列的两侧是两个引物。将所需突变并入内部引物中，并在第二轮PCR中引入突变。一般来说，PCR反应的特**随着引物中错配核苷酸数目的增加而降低。然而，由于套式PCR可以提高PCR反应的特**，因此具有大规模突变的长内引物可以用于引物延伸。

反向pcr

反PCR是通过设计已知DNA序列引物来扩增未知DN**段的方法。它可以用于大规模地替代、删除或**核苷酸。

定点突变的应用如下。

1. 研究蛋白质的结构、功能和催化性质
2. 改善蛋白质的性质（蛋白质工程）
3. 引入或去除限制性内切酶位点。

如何设计用于定点突变的引物

定点突变是通过引物引入所需突变的过程。突变可以是替换、**或缺失。由于PCR的特**随着引物中错配核苷酸的增加而降低，传统的PCR只能在靶序列中引入一个或两个碱基对的变化。其他方法，如引物延伸和反向PCR，可以用来引入大规模突变。定点突变的引物设计如图2所示。

Figure 2: Primers for Site-Directed Mutagenesis

替代

对于替换，两个引物中的一个应该在引物中间包含所需的突变。在这里，包含突变的位点不会退火到目标序列，因为它形成了一种畸变。

删除

对于删除，在引物设计过程中可以忽略从目标中删除的序列。由于该序列被引物定位在远离侧翼区域的位置，因此在PCR过程中不会被扩增。

**

对于**，要添加的序列在引物设计期间缠绕在其中一个引物的5'端。因此，**的序列也可以保持连接到放大器。

结论

定点突变是一种将突变引入DNA序列的技术。这些突变可以是替换、**或缺失。传统的PCR可以引入小规模的突变。大规模突变可以引入引物延伸或反向PCR。突变的引入是通过将所需的突变并入引物来完成的。

引用

1.“定点突变方法。” 集成的DNA技术，这里提供。