定量或实时PCR是检测不同实验条件下基因表达相对变化的常规方法。QPCR过程中引物和探针的设计是影响检测质量和成功率的关键因素之一。QPCR引物的设计有几个原则：引物GC含量应为35-65%；底漆的熔化温度应在60-68℃°C类；还应避免二级结构，Gs或Cs的重复长度超过3碱基，以及引物二聚体的形成。

覆盖的关键领域

1.什么是QPCR-定义、过程、用途2.如何设计QPCR底漆-QPCR底漆设计指南

关键词：荧光染料、GC含量、熔融温度、引物、定量PCR（QPCR）

什么是质量控制报告(qpcr)？

QPCR是一种允许实时定量产品的PCR。荧光染料可用于PCR产物的定量，通过在每个步骤中标记它们。荧光标记的两种方法可用于QPCR分析。它们是使用荧光染料和荧光标记探针。荧光染料与PCR产物结合，探针与PCR产物退火形成稳定的三链DNA。qpcr中广泛使用的荧光染料是SYBR绿，而探针可以是Taqman。在QPCR过程中使用探针检测PCR产物可以得到更准确的结果，并提高检测的灵敏度。

Figure 1: Mechani** of QPCR

qpcr引物的设计

QPCR引物的设计对提高检测的可靠性、准确性和灵敏度至关重要。QPCR引物的设计指南如下所述。

1. PCR产物/扩增子大小–PCR产物的大小应为50-210碱基对。
2. 引物长度-引物长度应为19-23个核苷酸。
3. GC含量-引物的GC含量应为35-65%。
4. 熔化温度（Tm）-底漆的熔化温度应为60-68°C.测定的退火温度为5℃°C小于引物的Tm。
5. 外显子-外显子连接-当通过QPCR扩增cDNA时，引物应跨越外显子-外显子连接以避免污染DNA的扩增。
6. 重复和运行-应避免二核苷酸重复（tctc）和重复核苷酸（如taaagc）。
7. 3'互补性-应避免正、反向引物3'端的互补区域，以防止引物二聚体的形成。
8. 3'稳定性–应在底漆的3'端加入G或C残留物，以增加退火的稳定性。
9. GC夹钳-在引物5'端的一个或两个GC夹钳增加了退火的特**。
10. 特**-应通过BLAST检查引物的特**
11. SNP–引物不应包含任何已知的SNP（单核苷酸多态性）变异

在QPCR的底漆设计中可以使用几种在线工具，如Primer3、primerblast、IDT PrimerQuest、primerbank和OAT。

Figure 2: Formation of Primer-Dimers

引物的设计应以这样的方式避免在QPCR中形成引物二聚体。荧光染料检测PCR产物的关键是这些染料也与引物二聚体结合，从而产生假阳性结果。

结论

QPCR用于PCR产物的检测和定量。引物的设计是提高QPCR结果准确性的关键。因此，在设计QPCR引物时，严格遵循指南是非常重要的。

引用

1.“QPCR分析设计和优化。” LSR | Bio-Rad，可在此处获得。

Image Courtesy:

1.“塔克曼”由User:Braindamaged –由原始上传者（公共域）通过Comm*** Wikimedia2完成自己的工作。”Tzachi Bar“Primer dimers formation En”-通过Comm*** Wikimedia完成自己的工作（CC By-SA 3.0）